МИКРОСКОП

(от греч. mikros — малый и skopeo — смотрю), оптич. прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), не видимых невооружённым глазом. Различные типы М. предназначаются для обнаружения л изучения бактерий, органич. клеток, мелких кристаллов, структуры сплавов и др. объектов, размеры к-рых меньше мин. разрешения глаза (см. РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ), равного ОД мм. С помощью М. определяются форма, размеры, структура и др. хар-ки микрообъектов. М. даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.

Св-во линзы или системы из двух линз давать увеличенные изображения предметов было известно уже в 16 в. Первые успешные применения М. в научных исследованиях связаны с именами англ. учёного Р. Гука, установившего (ок. 1665), что животные и растит. ткани имеют клеточное строение, и голл. учёного А. Левенгука, открывшего с помощью М. микроорганизмы (1673—77). Разработка нем. физиком Э. Аббе (1872—73) теории образования изображений несамосветящихся объектов в М. способствовала развитию разнообразных методов микроскопич. исследований.

Оптическая схема и принцип действия микроскопа. Одна из типичных схем М. приведена на рис. 1. Объект 7, расположенный на предметном столике 10, освещается обычно искусств. светом от осветителя (лампа 1 и линза-коллектор 2) с помощью зеркала 4 и конденсора 6. Для увеличения объекта служит объектив 8 и окуляр 9. Объектив создаёт действительное перевёрнутое и увеличенное изображение 7' объекта 7. Окуляр образует вторично увеличенное мнимое изображение 7" обычно на расстоянии наилучшего видения D = 250 мм. Если окуляр сдвинуть так, чтобы изображение 7' оказалось перед передним фокусом окуляра Fок, то изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его можно получить на экране или фотоплёнке (см. МИКРОПРОЕКЦИЯ). Общее увеличением, равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра:

г=bГок.

Увеличение объектива выражается ф-лой: b=D/f'об, где D — расстояние между задним фокусом объектива F'об и передним фокусом окуляра Fок (т. н. оптич. длина тубуса М.); f'об— фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра, подобно увеличению лупы, выражается ф-лой:

Гок= 250/f'ок,

где f'ок — фокусное расстояние окуляра. Обычно объективы М. имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры от 7 до 15. Поэтому общее увеличение М. лежит в пределах от 44 до 1500. Ирисовые полевая диафрагма 3 и апертурная 5 служат для ограничения светового пучка и уменьшения рассеянного света.

Важной хар-кой М. явл. его разрешающая способность, определяемая как величина, обратная тому наименьшему расстоянию, на к-ром два соседних элемента структуры ещё могут быть видимы раздельно. Разрешающая способность М. ограничена, что объясняется дифракцией света. Вследствие дифракции изображение бесконечно малой светящейся точки, даваемое объективом М., имеет вид не точки, а круглого светлого диска (окружённого тёмными и светлыми кольцами), диаметр к-рого равен: d=l,22 l/А, где l —длина волны света и А — т. н. числовая апертура объектива, равная: А = пsina/2 (n — показатель преломления среды, находящейся между предметом и объективом, a — угол между крайними лучами конического светового пучка, выходящего из точки предмета и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки расположены близко друг от друга, их дифракц. картины накладываются одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещённости. Наименьшая относит. разница освещённостей, к-рая может быть замечена глазом, равна 4%. Этому соответствует наименьшее расстояние, разрешаемое в М., d=0,42d=0,51 l/А. Для несамосветящихся объектов предельное разрешение dпр составляет =l/(А+А'), где А'— числовая апертура конденсора М. Т. о., разрешающая способность (=1/d) прямо пропорц. апертуре объектива и для её повышения пр-во между предметом и объективом заполняется жидкостью с большим показателем преломления (см. ИММЕРСИОННАЯ СИСТЕМА). Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины А = 1,3 (у обычных «сухих» объективов А = 0,9).

Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличения М. Увеличение М. в пределах 500А—1000А наз. полезным, т. к. при нём глаз различает все элементы структуры объекта, разрешаемые М. При увеличениях св. 1000 А не выявляются никакие новые подробности структуры препарата; всё же иногда такие увеличения применяются, напр. в микрофотографии, при микропроекции.

Методы наблюдения (микроскопия). Структуру препарата можно различить, если разные его ч-цы по-разному поглощают и отражают свет либо отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти св-ва обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через разл. участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения, применяемые в микроскопии, выбираются в зависимости от хар-ра и св-в изучаемого препарата.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов с включёнными в них абсорбирующими (поглощающими свет) ч-цами и деталями. Таковы, напр., тонкие окрашенные срезы животных и растит. тканей, тонкие шлифы минералов. В отсутствии препарата пучок лучей из конденсора 6 (рис. 1) проходит через объектив 8 и даёт равномерно освещённое поле вблизи фокальной плоскости окуляра 9. Если в препарате 7 имеется абсорбирующий объект, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него свет (штриховая линия), что и обусловливает, согласно дифракц. теории, возникновение изображения. Метод может быть полезен и при неабсорбирующих объектах, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значит. часть пучка не попадает в объектив.

Метод светлого поля в отражённом свете (рис. 2) применяется для наблюдения непрозрачных объектов, напр. шлифов металлов 4.

Освещение препарата производится от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2 сверху через объектив 3, к-рый выполняет одновременно и роль конденсора. Изображение создаётся в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5; структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

М е т о д т ё м н о г о п о л я в п р о х о д я щ е м с в е т е (рис. 3) применяется для получения изображений прозрачных, неабсорбирующих объектов. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 проходит спец. т. н. к о н д е н с о р т ё м н о г о п о л я 3 в виде полого конуса и непосредственно в объектив 5 не попадает. Изображение создаётся только светом, рассеянным микрочастицами препарата 4. В поле зрения 6 на тёмном фоне видны светлые изображения ч-ц, отличающихся от окружающей среды по показателю преломления.

М е т о д у л ь т р а м и к р о с к о п и и, основанный на этом же принципе (освещение препарата в ультрамикроскопах производится перпендикулярно направлению наблюдения), даёт возможность обнаруживать сверхмелкие детали, размеры к-рых (=2•10-9 м) лежат далеко за пределами разрешения М. (см. УЛЬТРАМИКРОСКОП).

При наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете непрозрачные препараты (напр., шлифы металлов) освещают сверху специальной кольцевой системой, расположенной вокруг объектива и наз. э п и к о н д е н с о р о м.

Метод наблюдения в поляризованном свете (в проходящем и отражённом) применяется для исследования под М. анизотропных объектов (см. ОПТИЧЕСКАЯ АНИЗОТРОПИЯ), таких, как минералы, руды, зёрна в шлифах сплавов, нек-рые животные и растит. ткани и клетки. С помощью анализаторов и компенсаторов, к-рые включены в оптич. систему, изучается изменение поляризации света, прошедшего через препарат.

М е т о д ф а з о в о г о к о н т р а с т а служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, напр., живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при малом различии показателей преломления объекта и среды световая волна, прошедшая сквозь них, претерпевает разные изменения по фазе и приобретает т. н. фазовый рельеф. Эти фазовые изменения преобразуются в изменения яркости («амплитудный рельеф») с помощью спец. фазовой пластинки (фазового кольца), расположенной вблизи заднего фокуса объектива. Лучи, прошедшие через препарат, полностью проходят через фазовое кольцо, к-рое изменяет их фазу на l/4. В то же время лучи, рассеянные в препарате (отклонённые), не попадают в фазовое кольцо и не получают дополнит. сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в препарате разность фаз между лучами отклонёнными и неотклонёнными оказывается близкой к 0 или l/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения препарата они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата, в к-ром распределение яркостей воспроизводит указанный выше фазовый рельеф.

М е т о д и н т е р ф е р е н ц и о н н о г о к о н т р а с т а состоит в том, что каждый луч, входящий в М., раздваивается: один проходит сквозь наблюдаемую ч-цу, а второй — мимо неё. В окулярной части М. оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей d, к-рая выражается ф-лой: d=Nl=(n0-nm)d, где n0, nm — показатели преломления соответственно ч-цы и окружающей среды, d — толщина ч-цы, N — порядок интерференции. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференц. контраста показана на рис. 4.

Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рисунке диагональными стрелками), первая из к-рых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференц. контраста в нек-рых отношениях сходен с методом фазового контраста — оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Отличие интерференц. метода от метода фазового контраста заключается гл. обр. в возможности с высокой точностью (до l/300) измерять разности хода, вносимые микрообъектом, используя компенсаторы. На основании этих измерений можно производить количественные расчёты, напр., общей массы и концентрации сухого в-ва в клетках биол. препаратов.

Метод исследования в свете люминесценции основан на том, что под М. изучается зелено-оранжевое свечение объекта, возникающее при его освещении сине-фиолетовым или УФ светом (см. ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ). Для этой цели перед конденсором и после объектива М. вводят соответствующие светофильтры. Первый из них пропускает от источника-осветителя только излучение, вызывающее люминесценцию объекта, второй (после объектива) пропускает к глазу наблюдателя только свет люминесценции. Метод применяется в микробиологии, цитологии, микро-хим. анализе, дефектоскопии и т. п.

М е т о д н а б л ю д е н и я в У Ф л у ч а х позволяет увеличить предельную разрешающую способность М., пропорциональную 1/l Этот метод расширяет возможности микроскопич. исследований также за счёт того, что ч-цы многих в-в, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определ. длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографированием, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана.

Метод наблюдения в ИК лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электронно-оптич. преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутр. структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, напр. тёмных стёкол, нек-рых кристаллов, минералов.

Основные узлы микроскопа. Кроме указанных выше оптич. узлов (напр., объектив, окуляр), в М. имеются также штатив или корпус, предметный столик для крепления препарата, механизмы для грубой и точной фокусировки, устройство для крепления объективов и тубус для установки окуляров.

Применение того или иного типа конденсора (светлопольные, темнопольные и т. д.) зависит от выбора необходимого метода наблюдения.

Объективы в большинстве совр. М. съёмные. По исправлению хроматических аберраций объективы разделяются на ахроматы, наиболее простые по устройству, и апохроматы, к-рые имеют улучшенную хроматич. коррекцию. Для исправления кривизны поля используются п л а н а х р о м а т ы и п л а н а п о х р о м а т ы, имеющие плоское поле зрения, что особенно важно для микрофотографии.. Кроме того, объективы различаются: а) по спектр. хар-кам — на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые и зеркально-линзовые); б) по длине тубуса, на к-рую они рассчитаны (в зависимости от конструкции микроскопа); в) по среде между объективом и препаратом — на сухие и иммерсионные; г) по методу наблюдения — на обычные, фазово-контрастные и др.

Тип применяемого о к у л я р а при данном методе наблюдения определяется выбором объектива М. Окуляры Гюйгенса рассчитаны для объективов-ахроматов мелких и средних увеличений, окуляры компенсационные — для апохроматов, фотоокуляры — для проекций н т. д.

Приспособления к М. позволяют улучшить условия наблюдения и расширить возможности исследований, осуществлять разные виды освещения препаратов, определять размеры объектов, фотографировать препараты через М., производить микроспектрофотометрирование и т. п.

Типы микроскопов определяются либо областью применения, либо методом наблюдения. Биологические М. предназначены для исследований в микробиологии, гистологии, цитологии, ботанике, медицине, а также для наблюдения прозрачных объектов в физике, химии и т. д. В биол. исследованиях используются также люминесцентные и инвертированные М. В последних объектив располагается под наблюдаемым объектом, а конденсор — сверху. Эти М. предназначены для исследования культуры тканей, находящихся в питат. среде, и снабжены термостатирующимп камерами, а иногда и устройствами для киносъёмки медленных процессов. М е т а л л о г р а ф и ч е с к и е М. предназначены для исследования микроструктур металлов и сплавов.

Снятые таким М. микрофотографии нетравленого шлифа металла представлены на рис. 5 (а — в светлом поле, б — с фазово-контрастным устройством). П о л я р и з а ц и о н н ы е М. снабжены дополнительно поляризац. устройствами и предназначены гл. обр. для исследования шлифов минералов и руд. С т е р е о м и к р о с к о п ы служат для получения объёмных изображений наблюдаемых предметов. И з м е р и т е л ь н ы е М. предназначены для разл. точных измерений в машиностроении.

Кроме этих групп М., имеются специализированные М., напр.: микроустановка для киносъёмки быстрых и медленных процессов (движение микроорганизмов, процессы деления клеток, роста кристаллов и т. п.): М. для изучения следов яд. ч-ц в фотоэмульсиях; высокотемпературные М. для исследования объектов, нагретых до 2000°С; хирургич. М. слабого увеличения, применяемые при операциях; интерференционные М. для количеств. исследований. Весьма сложными приборами явл. микроспектрофотометрич. установки для определения спектров поглощения препаратов, телевизионные анализаторы микроизображений и др. Первые представляют собой сочетание микроскопа со спец. монохроматорами и устройствами для измерения световых потоков; во вторых М. работает совместно с телевизионными и электронными системами, к-рые производят автоматич. определение геом. хар-к изучаемых структур.